荧光素酶(Luciferase)是自然界中能发出荧光的酶的统称,可以通过酶促反应催化底物产生自发荧光,能极其灵敏、高效地检测基因的表达。在生物技术和分子生物学中,荧光素酶常被用作报告基因,以检测基因表达或追踪生物过程。通过AAV载体将荧光素酶基因传递到细胞中,可以在细胞中表达荧光素酶,从而利用荧光素酶的荧光特性来检测基因表达或追踪生物学过程。
应用范围
①验证miRNA同靶基因的mRNA靶向互作:该应用的原理是miRNA是真核生物中具有调控功能的非编码RNA,可以通过碱基互补配对的方法结合靶基因的3'-非翻译区(UTR),并根据互补程度降解靶基因或阻遏靶基因翻译。将待测靶基因的预测靶向序列插入报告基因载体中F-Luc的3'-UTR区域,再共转入该miRNA mimics,如果荧光素酶活性下降,则提示待测序列为miRNA的靶序列。
②启动子/增强子结构分析:将启动子区域序列(通常2k左右)进行分段截短,或对特定位点进行突变,再分别构建入luciferase报告载体中替换启动子序列,检测其启动子活性。
③验证特定转录因子与其调控序列的作用:将预测的与转录因子互作的启动子序列插入报告基因载体,同时在实验细胞中共转过表达该转录因子,可分析转录因子过表达是否提高荧光素酶活性。
④ 验证信号通路活化:将通路相关的下游应答元件构建入报告基因载体的启动子区域,若通路被活化则荧光素酶活性升高。